【靶点模型+诊断质控】BCR-ABL1的药物开发和诊断

慢性粒细胞白血病（chronicmyelogenousleukemia，CML）也称为慢性髓细胞白血病、慢性髓性白血病或慢性粒细胞白血病)是一种骨髓增殖性肿瘤，表现为成熟和未成熟的粒细胞失调控的生成和不受控制的增殖，细胞分化大体正常。

CML与2个基因的融合有关：BCR(位于22号染色体)基因和ABL1(位于9号染色体)基因形成BCR-ABL1融合基因。这种异常融合通常是由于9号染色体和22号染色体相互易位，即t(9;22)(q34;q11)，产生一种异常的22号染色体，称为费城(Ph)染色体，这种衍生的22号染色体含BCR-ABL1融合基因。

图1. 染色体异位形成BCR-ABL1融合 

 

BCR-ABL1融合基因可以产生一种*的基因产物，即BCR-ABL1融合蛋白。该蛋白产物包含一个来自正常ABL1的酶促结构域，具有酪氨酸激酶催化活性；相对于正常ABL1的激酶活性受到严格调控，由于与BCR部分融合，BCR-ABL1的激酶活性增高且呈组成型表达，这种失调控的酪氨酸激酶参与了CML的发病机制。

BCR-ABL1融合基因多见于 95% 以上的 CML， 根据BCR基因的断裂位点不同，可分为主要断裂 点簇集区（major，M-BCR，E13A2 或 E14A2，编码 p210）、次要断裂点簇集区（minor，m-BCR，E1A2， 编码 p190）、微小断裂点簇集区（micro，μ-BCR， E19A2，编码 p230）。大多数 CML 表达 p210；极少 数表达 p230，其化疗敏感性较低；约 2/3 的 Ph+ ALL 表达 p190。

图2. BCR-ABL1融合的分型

 

图3. BCR-ABL 激活的分子途径的示意图
 

BCR Tyr177的Bcr-Abl磷酸化对于BCR-ABL介导的白血病发生至关重要。BCR-ABL/GRB2复合体招募SOS，它与GRB2SH3结构域组成性相关。BCR-ABL/GRB2/SOS复合物刺激非活性GDP结合形式的Ras转化为其活性GTP结合状态，并激活支架接头GAB2。因此，GRB2/GAB2/SOS复合物引起RAS下游通路的组成型激活，从而激活MEK1/2和MAPK蛋白并导致细胞增殖异常。

 

此外，BCR-ABL通过PI3K/AKT/FOXO4并最终通过mTOR的上调有效阻断重要的细胞过程，如自噬。

 

BCR-ABL蛋白转化活性的另一个假定核靶标是原癌基因MYC，它在CML细胞中高水平表达。MYC激活似乎独立于RAS途径，但直接被ABLSH2区域上调。

 

尽管BCR-ABL激活的通路列表看似无休止地扩展，并且在这些通路中揭示的复杂性日益增加，但BCR-ABL的所有转化功能似乎都取决于其酪氨酸激酶活性。这种先决条件在开发更复杂的靶向治疗方面具有令人难以置信的内在临床潜力。

 

BCR-ABL1的诊断
 

在NCCN指南和专家共识中，推荐的诊断方法一般分为3种，FISH、q-PCR、Sequencing，FISH可以定性的层面发现BCR-ABL1的异位，同样的也可以做核型分析，发现9号和22号的变化。Q-PCR侧重发现BCR-ABL1在mRNA水平的表达量变化，既能定性，也能定量。测序技术的发展能很好的帮助BCR-ABL1的检测，不管是一代测序还是二代测序，可以从cDNA层面发现，也可以用gDNA层面发现目的基因的变化。

 

标准品
 

科佰生物作为一家专业提供分子诊断标准品的公司，提供关于BCR-ABL1多种形式的产品（gDNA、RNA、ctDNA、FFPE等等），涉及多种技术平台，对整个流程做质控管理，也适合LDT和IVD的开发验证。

表1. 常见BCR-ABL1的分子诊断标准品

 部分数据展示 

图4. Sanger sequencing of BCR(E14)-ABL1(E2) for RNA



图5. Sanger sequencing of BCR(E13)-ABL1(E2) for RNA



图6. Sanger sequencing of BCR(E14)-ABL1(E2) Translocation for gDNA
 

BCR-ABL1的药物开发
 

伊马替尼是第一个上市的BCR-ABL1的TKI，可选择性抑制 c-ABL1、c-KIT 及 PDGFRα/β的酪氨酸激酶活性，但是一线治疗后，还是出现了BCR-ABL1依赖性和不依赖性的耐药。

图7. BCR-ABL的TKI在cell-based assay中对WT和不同的耐药突变的IC50（nM）

药物靶点模型
 

针对BCR-ABL1及其常见的耐药位点，科佰生物开发了多种cell-based kinase assay模型，可以用于TKI的in vitro和in vivo的活性检测，适合早期的化合物测活筛选，也适合后期的产品放行QC。

表2. 部分常见的BCR-ABL1的药物研发模型
 

其他更多的位点（比如M244V，G250E，D276G，P465S，V468F，I502L，P223S，K294E， E355G等等），正在开发中。
 

 部分数据展示 

图8. Anti-proliferation assay of three reference compounds on the BCR-ABL1/BaF3 Stable Cell Line.



图9. Anti-proliferation assay of three reference compounds on the BCR-ABL1[T315I]/BaF3 Stable Cell Line.


图10. Anti-proliferation assay of three reference compounds on the BCR-ABL1[T315I Q252H]/BaF3 Stable Cell Line.